Depto. Ciências Biológicas

LCB 208  BIOQUIMICA    

ENZIMAS 2

 

Prof. Dr. Luiz Antonio Gallo 

Colaboradores: Giuliana Castro Magalhães e Paulo F. Mendes Filho

 

I- CONCEITO

 

As enzimas são proteínas especializadas em catalisar reações biológicas, ou seja aumentam a velocidade de uma reação química sem interferir no processo. Elas estão associadas a biomoléculas, devido as suas extraordinária especificidade e poder catalítico.

 

I- a.  História

 

O nome enzima provém de "in yeasts", no qual suspeitava-se que as catálises biológicas estavam envolvidas com a fermentação do açúcar em álcool.

 A primeira descoberta foi feita por Payen e Persoz em 1833, quando encontraram uma substância termolábil no precipitado do álcool, extrato de malte, que convertia amido em açúcar, mais tarde denominada amilase. A primeira teoria foi publicada em 1835 por Berzelius. Pasteur em 1860 postulou que as enzimas estão associadas à estrutura e a vida da célula.

Em 1877 Buchener obteve sucesso na extração de enzimas de células de leveduras que catalisavam a fermentação alcóolica. Isto demonstrou que estas enzimas catalisavam a maioria das vias metabólicas energéticas e podem funcionar independentemente da sua estrutura.

A enzima foi primeiramente isolada na forma cristalina, mas isto foi compreendido melhor quando Summer em 1926 isolou urease de feijão e evidenciou que estes cristais consistem em proteínas.

Hoje 2000 diferentes enzimas são conhecidas, nas quais muitas são isoladas na forma pura homogenizada e 200 na forma cristalizada.

 

 

II- NATUREZA E ESTRUTURA ENZIMÁTICA

 

         Todas as enzimas são proteínas, mas nem todas as proteínas são enzimas. As proteínas, como um todo, ocupam um papel de destaque na dinâmica e estruturação dos organismos vivos.

         As enzimas, parte deste grupo de proteínas, funcionam como catalisadores, permitindo que uma reação química venha a ocorrer dentro dos limites das temperaturas biológicas.

         Para um perfeito entendimento sobre a estrutura de uma enzima e como esta funciona, devemos considera-la tanto como uma proteína quanto um catalisador biológico.

         Como uma proteína a enzima apresenta blocos de construção denominados aminoácidos. Algumas proteínas, tais como ribonucleases, quimiotripsina e tripsina, são constituídas apenas de aminoácidos. Outras proteínas, além dos aminoácidos, contêm componentes orgânicos e inorgânicos e são denominadas de proteínas conjugadas. A peroxidase e a catalase são exemplos de enzimas com estrutura conjugada e que apresentam porfirina férrica como cofator.

         As ligações peptídicas que ligam cadeias lineares de aminoácidos caracterizam a estrutura primária das proteínas.

         Considerando-se apenas a estrutura primária de uma proteína, a molécula deveria ser muito extensa e muito fina. Porém, muitas enzimas apresentam uma forma globosa em vez da fina fita linear, evidenciando estruturações de ordem superior, conhecidas como estrutura secundária, terciária e quaternária, que ocorrem em função de interações intrínsecas entre os blocos constituintes da molécula.

         A estrutura secundária de uma proteína é caracterizada pela formação de alfa hélices e folhas beta, conformações resultantes das interações acima mencionadas. Somente esta estrutura adicional explica como uma molécula de proteína possa ser tão compacta. Quando  as quatro pontes de dissulfeto que estabilizam a estrutura  de uma ribonuclease são reduzidas em uma solução de uréia, a cadeia polipeptídica assume uma conformação espiralada randômica e perde toda a sua atividade enzimática. Removendo-se a uréia e o agente redutor e deixando-se as pontes de dissulfeto restabelecerem-se, mais de 90% da atividade enzimática volta a ocorrer e as propriedades da molécula retornam àquelas do estado original.  

         Na estrutura terciária, a proteína está enrolada de uma maneira complexa e irregular, formando um prisma compacto, triangular e às vezes achatado. Nesta conformação os grupos heme e quase todos os resíduos de aminoácidos polares estão na superfície enquanto que quase todos os resíduos de aminoácidos não polares estão orientados para o interior da molécula. Consequentemente, os resíduos hidrofílicos estão expostos ao solvente, água, enquanto os resíduos hidrofóbicos são removidos da água o quanto possível. Um número grande de diferentes ligações está envolvido na estabilização desta conformação terciária. Estas incluem ligações eletrostáticas, pontes de hidrogênio, pontes hidrofóbicas, pontes dipolares e pontes de dissulfeto.

         Muitas enzimas são compostas de uma cadeia polipeptídica simples. Este é caso de enzimas como a ribonuclease, lisosima, tripsina,pepsina e algumas alfa amilases. Ao contrário, existe um grande número de enzimas que são compostas por mais de uma cadeia peptídica. A enzima lactato-desidrogenase é composta por quatro cadeias polipeptídicas. A repetição das cadeias polipeptídicas na construção de uma macromolécula de proteína caracteriza a estruturação quaternária que esta pode assumir.

           

 

III-  NOMENCLATURA E CLASSIFICAÇÃO DAS ENZIMAS:

 

         A nomenclatura das enzimas tem sido utilizada de várias maneiras. A mais utilizada é feita pela adição do sufixo ase ao nome do substrato (chamada de Nome Recomendado), ou seja, a molécula na qual a enzima exerce sua ação catalítica. Neste caso, a enzima urease catalisa a hidrólise da uréia em amônia e CO2, a arginase catalisa a hidrólise da arginina em ornitina e uréia, e a fosfatase catalisa a hidrólise de ésteres de fosfato.

         Entretanto, esta nomenclatura simples não tem se mostrado prática uma vez que muitas enzimas recebem denominações que, do ponto de vista químico, são muito pouco informativos. Por esta razão, e também devido à descoberta de novas enzimas, foi proposta uma classificação sistemática recomendada por uma comissão internacional de especialistas no estudo de tais macromoléculas.

         O novo sistema de classificação divide as enzimas em seis Classes principais, nas quais estão inclusas subclasses de acordo com o tipo de reação catalisada. De acordo com esta sistemática, cada enzima é designada por um Nome Recomendado, usualmente pequeno e apropriado para o uso diário, um Nome Sistemático, o qual identifica a reação catalisada, e um Número de Classificação, o qual é usado quando uma identificação precisa é necessária. Como exemplo do novo sistema de classificação, considere a reação abaixo catalisada por uma enzima:

 

ATP + creatina « ADP + fosfocreatina

 

O Nome Recomendado para esta enzima, que é o normalmente usado, é creatininaquinase e o Nome Sistemático, baseado na reação catalisada, é ATP:creatina fosfotransferase. Seu número de classificação é EC 2.7.3.2, onde EC representa Enzyme Commission of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology - IUBMB, o primeiro dígito, 2, a Classe (transferase), o segundo dígito, 7, a Subclasse (fosfotransferase), o terceiro dígito, 3, a Sub-subclasse em que a fosfotransferase apresenta um grupo nitrogenado como aceptor, e o quarto dígito, 2, designa uma creatina quinase. O quadro abaixo relaciona os códigos utilizados para a aplicação do número de identificação das enzimas.

 

 Classificação das Enzimas Segundo a Comissão de Enzimas

1. Oxido-redutases (reações de oxidação-redução ou transferência de elétrons –

 Desidrogenases e Oxidases)

            1.1.atuando em CH-OH

 1.2.atuando em C=O

 1.3.atuando em C=O-

 1.4.atuando em CH-NH2

 1.5.atuando em CH-NH-

 1.6.atuando em NADH, NADPH

2.Transferases (transferem grupos funcionais como amina, fosfato, acil, carboxilQuinases e Transaminases)

 2.1.grupos com um carbono

 2.2.grupos aldeído ou cetona

 2.3.grupos acil

 2.4.grupos glicosil

 2.7.grupos fosfatos

 2.8.grupos contendo enxôfre

3.Hidrolases (reações de hidrólise de ligação covalente - Peptidases)

 3.1.ésteres

 3.2.ligações glicosídicas

 3.4.ligações peptídicas

 3.5.outras ligações C-N

 3.6.anidridos ácidos

4.Liases (catalisam a quebra de ligações covalentes e a remoção de moléculas de água, amônia e gás carbônico – Dehidratases e Descarboxilases)

 4.1. =C=C=

 4.2. =C=O

 4.3. =C=N-

5.Isomerases (reações de interconversão entre isômeros óticos ou geométricos - Epimerases)

 5.1.racemases

6.Ligases (catalisam reações de formação de novas moléculas a partir da ligação entre duas pré-existentes, sempre às custas de energia - Sintetases)

 6.1. C-O

 6.2. C-S

 6.3. C-N

 6.4. C-C

 

 

IV- CINÉTICA DA CATÁLISE ENZIMÁTICA

 

         A cinética enzimática é a parte da Enzimologia que estuda a velocidade das reações enzimáticas bem como os fatores que a influenciam.

         Os princípios gerais da cinética das reações químicas aplicam-se às reações catalisadas enzimaticamente, embora estas também mostrem um padrão distinto que não é usualmente encontrado nas reações não enzimáticas: saturação com o substrato.

         No gráfico ao lado podemos observar o efeito da concentração do substrato na taxa de uma reação catalisada por uma enzima, A P. Em concentrações de substrato muito baixas, a velocidade inicial de reação v0 é quase proporcional à concentração da concentração do substrato e a reação é de primeira ordem em relação ao substrato. Entretanto, a proporção que a concentração do substrato aumenta, a taxa inicial passa a crescer menos, significando que não é mais proporcional  à concentra

ção do substrato. Nessa zona, as ordens das reações estão misturadas. Com o posterior aumento na concentração do substrato, a taxa de reação torna-se essencialmente independente da concentração do substrato e aproxima-se assintoticamente  a uma taxa constante. Nesses valores de concentrações de substrato a reação é de ordem zero em relação ao substrato e a enzima é tida como estando saturada com o substrato.

         Todas as enzimas apresentam o efeito da saturação, porém variando consideravelmente no que diz respeito à concentração requerida para produzi-lo. Esse efeito de saturação levou alguns pesquisadores a estabelecerem a hipótese de que enzima e substrato reagem reversivelmente para formar um complexo, passo essencial na catálise de uma reação.

         Em 1913 a teoria da ação e cinética enzimática foi desenvolvida por dois cientistas chamados L. Michaelis e M. L. Menten, na qual uma reação enzimática pode ser expressa pela seguinte equação, considerando-se apenas um substrato:

 

Enzima + Substrato  [EnzimaSsubstrato] Enzima + Produto

 

         As moléculas do substrato passam por uma série de formas geométrica e eletricamente alteradas antes de formarem produtos da reação e a energia livre destes intermediários, especialmente aquelas que se encontram em estados de transição mais instáveis, são os mais determinantes da taxa de reação. As enzimas têm muito maior afinidade por estes estados de transição do substrato do que têm por formas mais estáveis. Como esta interação abaixa a energia destes estados de transição críticos, as enzimas podem acelerar uma determinada reação.

         A partir do modelo de reação proposto por estes pesquisadores, desenvolveu-se uma equação que nos permite demonstrar como a velocidade de uma reação varia em função da concentração do substrato, a qual está a seguir descrita:

 

V0 =

 

 

         Esta equação relaciona a velocidade (V0), a velocidade máxima (Vmax) e a concentração inicial de substrato com a constante de Michaelis-Menten (Km). O Km de um substrato é a concentração do substrato na qual a velocidade inicial de reação equivale à metade da velocidade máxima. Para reações que envolvem um substrato é expressa em moles por litro e é independente da concentração da enzima. O quadro abaixo relaciona algumas enzimas e seus respectivos Km.

 

Enzima

Substrato

Km  (mM)

Catalase

H2O2

25

Hoxoquinase

Glicose

Frutose

0,15

1,5

Quimiotripsina

N-benzoltirosinamida

N-formiltirosinamida

N-acetiltirosianamida

Gliciltirosinamida

2,5

12,0

32

122

Anidrase carbônica

HCO3-

9,0

Glutamato desidrogenase

Glutamato

a-cetoglutarato

NH4+

NADox

NADred

0,12

2,0

57

0,025

0,018

Aspartato amininotransferase

Aspartato

a-cetoglutarato

Oxalacetato

Glutamato

0,9

0,1

0,04

4,0

 

Pode-se observar pelo quadro apresentado que os valores de Km não são fixos e podem variar com a estrutura do substrato, com o pH e com a temperatura. Para enzimas que atuam em mais de um substrato, cada substrato tem um Km característico.

A constante de Michaelis-Menten de uma enzima é, portanto, uma característica muito importante e fundamental, não apenas matematicamente na determinação da velocidade da reação catalisada como também na avaliação da atividade e na purificação das enzimas nos tecidos.

 

 

V-  MECANISMO DA AÇÃO ENZIMÁTICA

 

V- a.  Enzima como catalisador

 

O princípio  de catalisador é diminuir a energia de ativação.  A enzima se liga a uma molécula de substrato em uma região específica denominada sítio de ligação. Esta região é um encaixe que apresenta um lado envolvido por cadeias de aminoácidos que ajudam a ligar o substrato, e o outro lado desta cadeia age na catálise.

Em 1894 Emil Fischer propôs o modelo chave – fechadura para explicar a ação enzimática. A enzima se encaixa com o substrato específico no sítio ativo, como uma chave e fechadura.

 


 

 

Tanto a enzima quanto o substrato sofrem conformação para o encaixe. A enzima não aceita simplesmente o substrato, o substrato é distorcido para conformação exata do estado de transição, denominado encaixe por indução, proposto por Koshland (1958).

 

 


 

 

A enzima também encontra o lado específico da cadeia posicionando no lugar exato da ligação no processo catalítico, muitas vezes o lado da cadeia pode ser básico ou ácido promovendo a adição ou remoção de prótons. Em outras circunstâncias a enzima se agrupa a um íon metálico na posição correta para a ocorrência da catálise.

Ao completar a reação catalítica a enzima libera o produto e retorna a forma original. O processo ocorre em duas etapas:

 

(1)   S + E             ES*         (etapa reversível)

(2)   ES                  E + P      (etapa irreversível)

 

* complexo enzima-substrato

 

V- b.  Inibição Enzimática

 

Muitos tipos de moléculas inibem as enzimas e podem agir de várias formas. A principal distinção é entre inibição reversível e inibição irreversível.

A forma que envolve ligações não-covalentes é reversível, através da remoção do inibidor. Em alguns casos as ligações não-covalentes podem ser irreversíveis sob diferentes condições fisiológicas.

Já a inibição irreversível, a ligação molecular é covalente. São geralmente encontrados em reações que apresentam toxinas específicas.

 

V- b.1. Inibição Reversível

 

Existem vários modos que estão envolvidos com ligação não covalente, eles diferenciam quanto ao mecanismo pelo qual diminuem a atividade enzimática e como eles afetam na cinética da reação.

 

V- b.1.1. Inibição Reversível Competitiva

 

Uma molécula apresenta estrutura semelhante ao substrato da enzima que se liga para realizar a catálise, ela poderá aceitar esta molécula no seu local de ligação, mas não pode levar ao processo catalítico, pois ocupando o sítio ativo do substrato correto. Portanto o inibidor compete pelo mesmo local do substrato.

O efeito da reação modifica o Km, mas não altera a velocidade.

 

 
 

 


 


 


 


 

  

 

 

V- b.1.2.  Inibidor Reversível não Competitivo

 

Ocorre quando um molécula ou íon pode se ligar em um segundo local na superfície enzimática (não no sítio ativo). Isto pode distorcer a enzima tornando o processo catalítico ineficiente.

 

 


 

 

O inibidor não competitivo pode ser uma molécula que não se assemelha com o substrato, mas apresenta uma grande afinidade com a enzima. É o mecanismo inverso do inibidor competitivo, porque inibe a ligação do complexo ES e não da enzima livre.

O efeito da reação modifica a velocidade e o Km permanece constante.

 


 

 
 

V- c. Inibição Irreversível

 

Algumas substâncias se ligam covalentemente às enzimas deixando-as inativas. Na maioria dos casos a substância reage com o grupo funcional no sítio ativo bloqueando o local do substrato, deixando a enzima cataliticamente inativa.

Inibidores irreversíveis podem ser extremamente seletivos pois são semelhantes ao substrato. São muito utilizados como resíduos, os quais apresentam grupos de átomos que se configuram semelhantemente ao estado de transição que se ligam ao substrato.

 

V- d.  Cofatores

 

Para alguns tipos de processos biológicos, apenas a cadeia protéica não é suficiente, por isso a proteína requer uma molécula denominada cofator a qual pode ser uma pequena molécula orgânica, denominada coenzima ou um íon metálico.

Os cofatores  são geralmente estáveis em temperatura alta. A catálise ativa enzima-cofator é denominada holoenzima, quando o cofator é removido, se mantém a proteína, a qual é catabolicamente inativa e é denominada apoenzima. 

 

Coenzimas

 

A molécula orgânica que se liga às enzimas para ativar uma reação, é denominada coenzima, cada tipo apresenta uma função química particular, algumas são agentes oxi-redutoras, outras transferidoras etc.

Como exemplo explanatório, consideramos a coenzima dinucleotídeo nicotinamida de adenina (NAD+). Esta molécula contém duas principais partes: a porção difostato adenosina, ligando uma ribose a uma nicotinamida. A outra porção é a parte final da molécula do NAD onde o anel de nicotinamida será imediatamente reduzido e ainda servir como agente oxidante. Uma reação típica que o NAD participa é na conversão do álcool em aldeídos e cetonas, o qual age como agente oxidante.

Algumas vezes é difícil distinguir uma verdadeira coenzima de um segundo substrato. Durante uma catálise, uma coenzima tem a capacidade de, através de oxi-reduções, ser reutilizada por outra enzima, voltando novamente a ciclo metabólico. Por exemplo o NAD após a oxidação do substrato, passa a NADH, ativa a reação, deixa a enzima e novamente será oxidada por um sistema de aceptor de elétrons, voltando a ser NAD e assim podendo se ligar a outra enzima. Já um segundo substrato nunca deixa a enzima, ele é reduzido e oxidado no ciclo metabólico.

Muitas coenzimas são fortemente relacionadas com vitaminas. As vitaminas são moléculas orgânicas essenciais para o processo biológico em organismos superiores e não podem ser  sintetizados por eles mesmos. Portanto estas coenzimas são essenciais aos processos metabólicos vitais dos organismos superiores.

Outra estrutura que apresenta a mesma função de coenzima, são as metaloenzimas.  São enzimas que têm íons metálicos ligados covalentemente  nas cadeias de aminoácidos ou em grupos prostéticos como o grupo heme. Os metais que se ligam as enzimas agem como metais catalíticos  em reações hidrolíticas e outros com agentes redutores.

 

 

VI- TÉCNICAS EMPREGADAS NO ESTUDO DAS ENZIMAS

 

VI-    1) Análise de Velocidade de reação catalítica

 

Existem duas formas essenciais para o estudo da cinética de uma enzima. Primeiramente deve ser feito medições sob condições na qual  mantenha o estado de equilíbrio, depois observar a aplicabilidade da equação de Michaelis-Menten, e determinar a velocidade de reação pela concentração do substrato e da enzima.

 

2 ) Análise do Equilíbrio de Reação

 

O equilíbrio de uma reação enzimática é estabelecido em segundos ou poucos minutos . Vejamos algumas técnicas de avaliação:

 

Espectrofotometria

 

É um método simples e apurado. É medido pela absorção de luz na região espectral do substrato ou produto formado na reação.

 

Fluorescência

 

É similar a metodologia de espectrofotometria. O substrato ou o produto deve emitir fluorescência neste espectro. A técnica é vantajosa por ser altamente sensível, a solução a ser empregada deve estar extremamente diluída.

 

Titulação automática 

 

 

É utilizada quando a reação produz ou consome ácido ou base. Titula-se na solução ácido ou base para que o pH continue constante. A quantidade de ácido ou base consumido é o valor da reação catalítica enzimática.

 

Análise Radioativa

 

 

É avaliado quando o substrato é marcado  com isótopo radioativo, o qual será perdido ou transferido durante a reação a ser estudada. É um método extremamente sensível para análise cinética enzimática.

 

 3) Análises de reações com alta velocidade

 

a)    "Stopped Flow"

 


 

A enzima e o substrato são inicialmente separados em seringas, que rapidamente libera seu conteúdo até uma câmara misturadora e em seguida passa para a seringa que pára a reação. Neste instante um detector mede a absorbância de luz ou fluorimetria.

 

 

b)    "Temperature Jump"

 

O processo ocorre quando a mistura de reação, que está em equilíbrio numa Temperatura 1, é rapidamente passada uma temperatura 2 . O ponto de equilíbrio mudará e a reação deve ocorrer para que a reação alcance um novo equilíbrio. A mudança rápida de temperatura é obtida por uma explosão de corrente elétrica nos eletrodos imergidos na mistura de reação. O tempo de relaxamento entre a mudança de temperatura é medido por absorbância ou fluorescência.

 


 

 

 

4) Análise quantitativa da atividade enzimática

 

Para obtenção de uma análise quantitativa é necessário saber:

 

-   Toda estequiometria de uma reação catalítica

-         Se a enzima requer adição de cofatores como um íon ou coenzima

-         A dependência da enzima sob a concentração do cofator ou substrato.

-         O pH ótimo

-         A  temperatura pela qual a enzima está estável e apresenta alta atividade.

-         O procedimento para determinação do aparecimento e desaparecimento do substrato de um produto de reação.

 

A análise quantitativa é confirmada quando o substrato ou o produto é colorido ou absorvido em luz ultravioleta. O valor de aparecimento ou desaparecimento do produto ou substrato absorvido por luz  pode ser analisado pelo espectrofotômetro. Além do produto ou substrato pode - se analisar o intermediário (aquele que serve como ponte para o desencadeamento de outra reação).

 

 

a) Purificação enzimática

 

As enzimas são encontradas na  natureza em misturas complexas, geralmente as células apresentam  centenas ou mais diferentes enzimas, para um estudo aprofundado deve-se purificar a enzima a ser estudada.

Em alguns casos é possível através da aplicação de métodos específicos utilizar enzimas nos estado impuro, mas na maioria dos casos, a presença de outras enzimas interfere nos substratos desviando as reações específicas.  

 

 b) Métodos de purificação

 

1)     Teste – primeiramente faz-se uma análise quantitativa da atividade da enzima a ser estudada. A enzima deve ser isolada utilizando - se o teste de  atividade em diferentes frações, sendo mais importante que a exatidão do método.

2)     Procedimento Geral – definição da unidade enzimática, concentração e atividade específica.

3)     Origem enzimática – determinação do local (tecido) de maior quantidade, geralmente a rápida centrifugação adquire enzimas mitocondrial.

4)     Extração – é necessário ter a enzima em solução e, portanto, a ruptura de membranas. Deve –se utilizar um tampão, pois ao romper o tecido pode ocorrer liberação de substâncias ácidas que degradam a enzima. Os métodos utilizados são o mecânico com partículas de areia, nitrogênio líquido, "shaker" em alta velocidade , ondas de ultrassom e solventes como acetona.

 

c) Unidade de atividade enzimática

 

É definida pela quantidade que causa transformação de 1 mmol de substrato por  minuto a 25°C sob condições ótimas. A atividade específica é o número de unidade de enzimas por miligrama de proteína, mede a pureza da enzima.

A atividade molar ou molecular ou  número de "turnover", é o número de moléculas do substrato transformado por uma única molécula de enzima ou único sítio de ligação em um minuto, quando  a enzima está no valor de limite. A  atividade molar pode ser calculada pela velocidade máxima.

A nova unidade internacional da atividade enzimática determinada pela "Comissão da Enzima" é o "katal", o qual é definido como a transformação do substrato em 1 mol por segundo.

 

Métodos de Fracionamento

 

O extrato de enzimas apresenta inúmeras substâncias com diferentes pesos moleculares e de acordo com seu interesse de estudo utilizam-se diferentes métodos:

 

1)     Precipitação por diferença de pH

2)     Desnaturação por aquecimento

3)     Precipitação  com solventes orgânicos (etanol, acetona)

4)     Precipitação por sais (sulfato de amônia)

5)     Adsorção

6)     Cromatografia - o mecanismo de separação depende da adsorção, troca iônica, afinidade específica para imobilizar ligantes específicos ou efeitos de peneiramento molecular.

7)     Eletroforese -  a mobilidade das proteínas é causada por campo elétrico

8)     Cristalização

9)     Concentração – redução de volume através de evaporação do solvente ou congelamento.

 

 

VII- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

 

- DIXON, M.; WEBB, E.C. Enzymes. New York:Academic Press, 1979.

1116 p.

 

- LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. L.; COX, M. M. Princípios de 

         Bioquímica. São Paulo: Sarvier, 1995. 839p.

 

- MATHEWS, C.K.; Van HOLDE, K. E. Biochemistry. The Benjamim

Cummings Publ. Co., Inc., CA- USA. 1995. 1159p.

 

-                                       RAWN, J. D. Biochemistry. USA, NC: Neil Patterson Publ., 1989. 1105p.

 

- WHITAKER, J. R. Principles of Enzimology for the Food Sciences. New

          York: Marcel Dekker Inc., 1972. 636p.